根据典型的下疳皮损，医生可初步诊断一期梅毒。硬下疳或出现在手掌和足底的典型皮疹常使医师怀疑梅毒。由于梅毒可以在各个阶段引起各种各样的症状，因此医生可能会在评估患者出现任何可能的症状（包括视力问题）时检查梅毒。
确诊有赖于实验室检查结果。有两种血液检查：
传统上，筛查试验首先完成，阳性结果通过确认（密螺旋体）试验证实。有时医生会先进行密螺旋体试验。如果结果为阳性，则进行快速血浆反应素试验（筛查试验）。
如果检测结果为阳性，医生可以询问患者以前的性伴侣、以前的化验结果以及以前的治疗方法，以帮助确定患者目前是否患有梅毒或是否曾患过梅毒。
当治疗取得成功后感染梅毒，初筛试验的结果会慢慢转阴（经数月到数年时间），但确诊试验的结果通常会永远保持阳性。
一期或二期梅毒也可使用暗视野显微镜确诊。通过获取患者皮肤溃疡或淋巴结液体样本在专门的光学显微镜下检测。黑暗的背景下显得明亮的细菌，使它们更容易识别。
在潜伏期，通过相同的血液测试（密螺旋体和非密螺旋体）来确诊梅毒。医生还尝试基于他们的评估结果确定该阶段为早期潜伏期梅毒还是晚期潜伏期梅毒，包括全面的体格检查和对以前的测试结果的回顾。
三期梅毒的诊断基于症状和抗体检测结果。根据存在不同的症状，完成相应的测试。例如感染梅毒，胸部X射线或其他成像测试检查有无主动脉动脉瘤。
如果怀疑神经梅毒，无论梅毒的分期为何，都需做（腰穿）采集脊髓液，以检测其中的病菌抗体。
梅毒患者还应接受其他 STD（包括 HIV 感染）的检测。
